氨基酸的生物活性及應(yīng)用    氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單元，也是合成機(jī)體抗體，激素和酶的原料，在人體內(nèi)有特殊的生理功能，是維持生命現(xiàn)象的重要物質(zhì)。氨基酸以肽鍵結(jié)合而存在于各種功能與結(jié)構(gòu)不同的蛋白質(zhì)分子中。蛋白質(zhì)是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)，它對機(jī)體的生長、維持、防御及生理功能極為重要。    迄今，氨基酸及其衍生物的品種超過100多種。廣泛地應(yīng)用于食品、飼料、化工、農(nóng)業(yè)及     醫(yī)藥等方面。氨基酸作為藥物在醫(yī)療保健事業(yè)中是一類占有重要地位和充滿希望的分支。    由于人們對氨基酸廣泛參與機(jī)體正常代謝和許多生理機(jī)能的認(rèn)識不斷加深，氨基酸代謝紊亂與疾病的關(guān)系以及在防治某些疾病中的重要作用等，愈來愈被人們所矚目。眾所熟知，氨基酸對處于蛋白質(zhì)—能量營養(yǎng)不良（Protein-Enerey Malnutrition, PEM)狀態(tài)病人的營養(yǎng)支持，早日康復(fù)，降低發(fā)病率與死亡率，具有非常重要的意義。目前，隨著中國腸外和經(jīng)腸營養(yǎng)支持療法的推廣應(yīng)用，氨基酸如同維生素、激素一樣，已成為現(xiàn)今臨床治療上不可缺少的藥品。    氨基酸作為某些疾病的治療藥物以及作為合成多肽類藥物的中間原料，應(yīng)用也較廣泛。至今已能工業(yè)生產(chǎn)的多肽類藥物有谷胱甘肽（3肽）、促胃液素（5肽）、催產(chǎn)素（9肽）、抗利尿素（9肽）、ACTH（24肽）及降鈣素（32肽）等已用于臨床。

用鹽酸調(diào)pH2.5，加碳脫色，濾液加乙醇存放結(jié)晶，過濾，醇洗，烘干，得L-賴氨酸鹽酸鹽：洗脫液濃縮成糖漿狀，加鹽酸調(diào)pH3.8～4.1，加4～5倍量75%乙醇，放置，冷卻結(jié)晶，得賴氨酸粗品。將粗品加水溶解，用少量乙醇洗濃縮器，合并，靜置，結(jié)晶。將結(jié)晶打碎抽濾至干，倒出結(jié)晶加70%乙醇攪成糊狀，抽濾去乙醇溶液，用70%乙醇洗一次，再用95%乙醇洗一次，抽干，烘干，得L-精氨酸鹽酸精品。    以上制得L-纈氨酸4.5kg(得率14.7%)，L-亮氨酸12kg(得率25%)，L-組氨酸鹽酸鹽5kg(得率19.6%)，L-精氨酸鹽6kg以上（得率37.5%).    從豬血粉水解液制備L-組氨酸及亮氨酸    操作過程：    水解 取豬血粉1.7kg，工業(yè)鹽酸5l和蒸餾水2l混合，油浴回流24h，加水稀釋至12l，加活性碳100g，80℃保溫30min，室溫放置12h，過濾，濾液減壓趕酸3次，每次加蒸餾水5l，最后加水稀釋成12l，調(diào)pH3～4，加活性碳200g，80℃保溫2h，冷卻至室溫，1～4℃放置2天，過濾去酪氨酸。濾液用6mon/L鹽酸調(diào)pH至2.5，即得上柱液。    上柱 上柱液通過φ7×80cm 732陽離子交換樹脂柱，5根串聯(lián)，流速為(r×10)ml/min(r為樹脂柱半徑），上柱完畢，用蒸餾水洗滌至pH5～6，用0.05mol/L氨水洗脫，開始收集流出液體至pH6.8為止，為含亮氨酸收集液，pH6.8～9.5為組氨酸收集液。同時改用0.1mol/L氨水洗脫至pH11為賴氨酸收集液。再用2mol/L氨水洗脫至茚三酮反應(yīng)消失為止，為精氨酸收集液。樹脂用2mol/L氨水浸泡再生。   

蠶蛹水解液中系統(tǒng)分離制備多種氨基酸       

操作過程：    原料處理 聚繅絲廠下腳料蠶蛹，經(jīng)壓榨去油并粉碎后相繼用汽油浸泡1～2日，回收汽油，得脫脂蠶蛹粉。    水解 脫脂蠶蛹粉3kg加6mol/L鹽酸15l，攪勻，膨脹后，置搪玻璃罐中徐徐升溫至110℃，保溫水解24～26h。    減壓脫酸 待水解液降溫至60℃以下，過濾，濾液減壓脫羧至原體積三分之一，濾渣用5倍于濾液的水洗滌，濾液與洗液合并，加水稀釋至100l(pH約為1.5～2.0)。    脫色 按上液的總量加1～2%活性碳。于90℃保溫攪拌2h，降至4～10℃靜置1～2日，使酪氨酸吸附和沉淀安全，抽濾，得淡橙黃色透明液體。    732樹脂陽柱純化、粗分 ①上述脫酸脫色液以130ml/min(44,2cm)流速上1號732陽柱 （φ150×1500mm，內(nèi)裝732陽樹脂20l)至飽和。②串聯(lián)2事情732陽柱（φ100×1400mm，內(nèi)裝732陽樹脂10l)，繼續(xù)上樣至飽和。用50～60l蒸餾水沖柱至中性，流速150ml/min(114.6cm/h)。穿漏液并入下次上柱液。③拆開2柱，分別再串1根732陽柱 （φ100×1400mm，內(nèi)裝732陽樹脂10l)。分別用0.1mol/L氨水洗脫，流速90ml/min(68.9cm/h)。洗脫液次用2l容器收集至pH約為11。④洗脫液逐瓶依次紙層析定性。展開劑為酚：水（3:1)。分別合并酸性氨基酸、中性氨基酸及賴氨酸等組分。    中性氨基酸進(jìn)一步分組 ①732陽柱分得的中性氨基酸組分，加0.5%碳脫色至無色澄清后，用稀氫氧化鈉緩緩調(diào)pH8～8.5，以90ml/min(68.9cm/h)流速上1號717陰柱（φ100×1400mm，內(nèi)裝717陽樹脂10l)至飽和。②串聯(lián)2事情717陰柱（φ100×1000mm，內(nèi)裝717陽樹脂61l)，用20～30l蒸餾水沖柱至pH約8，流速110ml/min(84cm/h)。③用0.1mol/L     鹽酸以70ml/min(53.5/h)流速洗脫。用500ml容器收集洗脫液18瓶左右。④串聯(lián)3號717陰柱，依法洗脫和收集500ml×27瓶左右。流速49ml/min(214.9cm/h)。⑤棄1號柱，串聯(lián)4號717陰柱（φ40×1300mm，內(nèi)裝717陽樹脂1.3l)，依法洗脫和收集至完。⑥逐瓶依次紙層析定性分組，展開劑為正丁醇：冰醋酸：無水乙醇：水=4:1:1:2。分別合并Gly、Ala為主和Leu、Val為主的組分。    酸性氨基酸的分離 ①酸性氨基酸組分用稀氫氧化鈉緩緩調(diào)pH5～6，以45ml/min（214.9cm/h)流速上第1根717陰柱（φ40×1400mm，內(nèi)裝717陽樹脂1.4l)至飽和。②串聯(lián)第2根717陰柱（φ40×1300mm，內(nèi)裝717陽樹脂1.3l)，繼續(xù)上樣至飽和。流速同前。③串聯(lián)第3根717陰柱（φ40×1200mm，內(nèi)裝717陽樹脂1.2l），依法上樣至完，必要時還可串聯(lián)1～2根717陰柱。④用蒸餾水4～6l沖柱至pH約8，流速50ml/min(239.9cm/h)。⑤拆開各柱，分別串聯(lián)1根717陰柱（φ40×1000mm，內(nèi)裝717陽樹脂1.0l）。分別用0.1mol/L鹽酸洗脫，流速35ml/min。分別用500ml容器依次收集洗脫液9瓶左右。然后分別再串1根717陰柱（規(guī)格同前）。依法洗脫和收集至茚三酮反應(yīng)微略止。⑥逐漸依次紙層析定性，展開劑為酚:水（3:1)。合并與標(biāo)準(zhǔn)Asp和Glu的Rf值相同組分。    717陰柱分離甘氨酸和丙氨酸 以Gly及Ala為主組的分用稀氫氧化鈉液緩緩調(diào)pH8左右，按照分離Asp和Glu的方法上樣和洗脫。采用正丁醇：冰醋酸：無水乙醇：水（4:1:1:2)系統(tǒng)紙層析定性，分別合并與標(biāo)準(zhǔn)Gly及Ala的Rf值相同組分。    732陽柱分離亮氨酸和纈氨酸 ①以Leu和Val為主的組分，用6mol/L鹽酸調(diào)pH3.5～4.0，以40ml/min流速按照分離Asp和Glu的方法上飽3根732陽柱。②用0.1mol/L氯化銨作洗脫劑，仍按分離Asp和Glu的方法洗脫和收集洗脫液。待纈氨酸洗脫完后，改用0.1mol/L氨-氨化銨脫亮氨酸。③采用正丁醇：冰醋酸：無水乙醇：水（4:1:1:2)系統(tǒng)紙層析定性，分別合并與標(biāo)準(zhǔn)Leu及Val的Rf值相同組分。   

材料：    血纖維 新鮮豬血纖維壓榨后，反復(fù)沖洗與搓擦至近白色，絞碎，冷水浸泡12h，甩干。    酶制劑 包括3942中性蛋白酶（活力200000U/g)、1398中性蛋白酶（活力30000U/g)、166放線菌蛋白酶（活力30000U/g)、胰酶（活力1：60）及豬腎勻漿（內(nèi)含亮氨酸氨基肽酶及氨酰脯氨酸二肽酶）等。    操作方法：    取血纖維25kg，加蒸餾水37.5kg，加熱至80℃以上變性30min，甩干，搓散后投入水解罐，加蒸餾水40～45l，攪拌并升溫至45℃，加3972（25g)及1398（175g），甲苯與氯仿各250ml，每0.5h攪拌10min，并以氫氧化鈣懸浮液調(diào)節(jié)并維持pH至7.0～7.2，48h后加酶制劑166(175g)，繼續(xù)水解8h，加腎勻漿1.5kg(內(nèi)含氯化錳40g)，維持pH7.5～8.0，40h后加亞硫酸氫鈉110g，以12mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至5.0，加熱至80℃保溫20min，過濾，將濾液以等體積的水稀釋，通過多也型陽離子交換樹脂（H型）。檢查流出液至有色氨酸反應(yīng)時停止上柱，用水洗柱，再用0.3mol/L氫氧化銨液洗脫，收集洗脫液（每瓶3l)。至流出液pH為12且無色氨酸反應(yīng)時停止洗脫。以單向紙層析檢查各瓶洗脫液，將含色氨酸的合并。減壓濃縮至沉淀析出，置冰箱24h以上，減壓過濾，結(jié)晶分別以65%與95%冷乙醇洗滌，得色氨酸粗品。調(diào)節(jié)濾液pH至6.0，又有大量結(jié)晶析出，靜置24h，過濾，結(jié)晶同上洗滌2次，合并兩次色氨酸粗品，60℃真空干燥8h，再用65%乙醇重結(jié)晶2次，95%乙醇洗1次，真空干燥8h，得量55g，收率1.1%(不抱括回收)。    腦內(nèi)游離氨基酸提取        取腦組織500mg，放入冰冷的10ml75%乙醇中勻漿化，將勻漿倒入50ml圓底小燒瓶中，再將勻漿管用5ml乙醇洗滌1次，一并倒入小燒瓶內(nèi)，于100℃水浴中回流提取20min。將液體倒入30min，將液體倒入15ml離心管中，4000rpm離20min，至產(chǎn)生泡沫后立即取出，將小三角燒放入冰箱內(nèi)，冷卻30min,將液體倒入15ml離心管，4000rpm離心2h。將上清液倒入50ml圓底燒瓶內(nèi)，于90℃水浴中繼續(xù)蒸去乙醇，將小燒瓶內(nèi)淡黃色水溶液倒入25ml分液漏斗中，然后用2ml重蒸餾水洗1次，并入分液漏斗中，再用乙醚分2次洗，也并入分液漏斗中，充分振搖，洗去脂類，放置10min，將下部水相放入圓底燒瓶中，于40℃水浴上蒸去乙醚，然后移至100℃水浴上減壓抽干樣品�？晒┌被�酸自動分析儀測定。    L-組氨酸精制    水結(jié)晶法：    原理 組氨酸和組胺類物質(zhì)均易溶于水，而不溶于乙醇。故不宜用乙醇結(jié)晶，以防微量組胺類物質(zhì)一起結(jié)晶起來。因組氨酸含量在98.5%以上，組胺類物質(zhì)含量在百萬分之幾，故采用飽和溶液結(jié)晶即可將兩者分離。    操作過程 稱取不合格組氨酸鹽432g，加800ml無離子水，于水浴上加熱使之全溶。再移至冷水溶中，不斷攪拌，結(jié)晶逐漸析出，溫度降至室溫后，真空抽濾，分離，用少量乙醇洗，烘干即得精品。    樹脂分離法：    原理 組氨酸和組胺類物質(zhì)都有一個咪唑基，易溶于水。組氨酸較組胺多一個羥基，故極性較大。利用組氨酸和組胺離子交換樹脂和水的引力不同，從而達(dá)到分離。        操作過程 ①離子交換：將從水結(jié)晶后的母液配制成含量在5%左右的濃度，用堿調(diào)pH10.0選用717（OH）樹脂500ml。離子交換柱規(guī)格φ5.5cm。上柱流速1%（V/V/min）,上柱量為樹脂體積的3倍，再用0.5mol/L鹽酸洗滌，用量是樹脂體積的3倍。收集上柱流出液和洗滌液。    ②濃縮、脫色、精制：將上柱流出液和洗滌液分別濃縮到原體積的十五分之一，濃縮液分別用濃鹽酸及濃氨水調(diào)pH4.0。視溶液顏色確定投碳量。于85℃攪拌脫色45min，分離，攪拌結(jié)晶，精制過程與水結(jié)晶法相同，母液可上柱回收。 蛋白質(zhì)濃縮、干燥及貯存 一、樣品的濃縮     生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進(jìn)行濃縮。常用的濃縮方法的：   1. 減壓加溫蒸發(fā)濃縮   通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發(fā)愈快，此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。   2. 空氣流動蒸發(fā)濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液，表面不斷通過 空氣流；或?qū)⑸�物大分子溶液裝入透析袋內(nèi)置于冷室，用電扇對準(zhǔn)吹風(fēng)，使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā)，而達(dá)到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適于大量溶液的濃縮。  3. 冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰，鹽類及生物大分子不進(jìn)入冰內(nèi)而留在液相中，操 作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然后緩慢地融解，利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達(dá)到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面，蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。       4. 吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液 不起化學(xué)反應(yīng)，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里，外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下，袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達(dá)到所需要的體積。   5. 超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進(jìn)行選擇性過濾的方 法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發(fā)展起來的新方法，最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽，并具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優(yōu)點。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇，不同類型和規(guī)格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數(shù)均不同，必須根據(jù)工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。